非小细胞肺癌驱动基因突变与临床病理特征的关系

作者：陈灵锋、陈小岩、俞训彬

来源：中华病理学杂志

肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，其中80%的肺癌为非小细胞肺癌（NSCLC）[1]。与癌症发生发展相关的重要基因称为驱动基因，大量临床研究表明驱动基因突变状态是靶向治疗疗效的重要预测因子。近来的一项研究分析显示根据驱动基因进行靶向治疗的患者显着提高了生存期，总体生存期中位数超过3年[2]。

美国国家综合癌症网络（NCCN）"非小细胞肺癌指南"（.V4）明确指出，在进行靶向治疗前需要对基因的突变状态进行检测，并强烈建议如果存在有效药物可进行更广泛的基因状态检测，因此对NSCLC患者多基因的联合检测可为患者提供更精准的治疗，明确各驱动基因在NSCLC中的发生率对临床实践具有重要指导意义。

我们采用蝎形探针扩增阻滞突变系统（scorpions ARMS）荧光定量PCR法检测205例原发性NSCLC手术切除组织中表皮生长因子受体（EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（ALK）、ROS1、RET、KRAS、NRAS、BRAF、HER2和PIK3CA基因突变，总结这9种基因的突变率、分布特点及其与临床病理特征的相关性。

资料与方法

1.研究对象：

收集福建省立医院病理科4月至4月间手术切除原发性NSCLC标本205例。根据WHO肺部肿瘤组织学分类标准分为：腺癌169例（82.4%，包含鳞屑样、腺泡样、乳头状、微小乳头状、实性、浸润性黏液和胎儿型腺癌），鳞癌30例（14.6%），腺鳞癌5例（2.4%），大细胞癌1例（0.5%）。曾经或正在吸烟55例，从未吸烟150例。具有明确病理p-TNM分期：Ⅰ期103例、Ⅱ期30例、Ⅲ期47例、Ⅳ期9例。标本均经4%中性甲醛液固定处理、石蜡包埋、切片及HE染色，由两名有经验的病理医师进行病理分型，并确定有足够的肿瘤细胞再行后续检测。

2.仪器与试剂：

实验仪器采用安捷伦科技有限公司的荧光定量PCR仪（Mx3000P美国）。甲醛固定石蜡包埋样本DNA/RNA共分离试剂盒及EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、BRAF、HER2和PIK3CA突变基因检测试剂均由厦门艾德生物医药科技股份有限公司提供。

3.组织DNA和RNA的提取：

切取3张5 μm厚度石蜡包埋组织样品，置于1.5 mL EP管内，二甲苯脱蜡后用甲醛固定石蜡包埋样本DNA/RNA共分离试剂盒提取基因组DNA和细胞总RNA。DNA和RNA分离完毕后，使用Nanodrop 2000测定DNA和RNA的浓度，DNA和RNA的A260/A280均介于1.8～2.1之间。

4.蝎形探针扩增阻滞突变系统荧光定量PCR：

使用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的检测试剂盒，根据试剂盒说明操作。PCR反应条件为：第一阶段：42 ℃ 5 min，95 ℃ 5 min，1个循环；第二阶段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，10个循环；第三阶段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，36个循环；信号收集：第三阶段60 ℃时收集FAM和HEX信号，执行实时PCR。

5.统计学分析：

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。采用连续校正卡方检验或Fisher精确概率法分析基因突变与临床病理特征的关系，以P

结果

1.一般情况：

原发性NSCLC 205例，年龄27～86岁，中位年龄为62岁，平均年龄61.7岁。9种驱动基因突变总发生率为71.2%（146/205），肺腺癌驱动基因总突变率达81.7%（138/169），分别为EGFR（63.3%，107/169）、KRAS（5.9%，10/169）、PIK3CA（4.1%，7/169）、ALK（4.1%，7/169）、ROS1（3.0%，5/169）、RET（3.6%，6/169）、HER2（1.8%，3/169）、NRAS（0.6%，1/169）和BRAF（0.6%，1/169），如图1所示。发现两个基因以上同时突变9例（4.4%），大部分为不吸烟患者（8/9），其中8例为合并EGFR突变，发现EGFR、KRAS和PIK3CA 3种基因同时突变1例。腺癌（P

表1 常见驱动基因突变与临床病理特征的关系[例，百分率（%）]

图1 肺腺癌驱动基因突变分布

2.EGFR突变的特点与NSCLC临床病理特征的关系：

205例原发性NSCLC中EGFR突变率为54.2%（111/205）。同时有第19和20号外显子突变或同时有第20和21号外显子突变各1例，第18～21号外显子的突变率分别为3.7%、52.3%、2.8%和46.7%。EGFR突变更容易发生在腺癌（P

3.KRAS突变的特点与NSCLC临床病理特征的关系：

本组实验对205例NSCLC样本同时进行KRAS基因第2号外显子常见位点突变（34G>T、35G>T、35G>A、35G>C、34G>C、34G>A、37G>T）检测，基因突变率为5.4%（11/205），以第12号密码子的突变最为多见（10/11）。突变频率最高为c.34G>T（p.G12C），占7/11。在碱基改变方面，碱基G→T突变最多见（9/11）。KRAS突变率在实性为主型和浸润性黏液腺癌更高（P＝0.015），与其他病理特征无关。

4.PIK3CA突变的特点与NSCLC临床病理特征的关系：

205例NSCLC患者中，PIK3CA突变率4.4%（9/205），以第20号外显子突变最为多见（6/9）。突变频率最高为c.3140A>T（p.H1047L），占4/9；c.1624G>A（p.E542K）占3/9；c.1633G>A（p.E545K）和c.3140A>G（p.H1047R）突变率较低。在腺癌中，≥62岁、浸润性黏液腺癌和胎儿型腺癌患者的PIK3CA突变率更高（分别为P＝0.015，P＝0.006），与其他病理特征无关。

5.EML4-ALK、ROS1、RET融合基因的特点与NSCLC临床病理特征的关系：

205例NSCLC患者中，融合基因总阳性检出率为9.8% （20/205），其中EML4-ALK阳性率为3.9%（8/205），8例融合类型均为EML4外显子13；ALK外显子20、EML4外显子6 ins 33；ALK外显子20或EML4外显子20；ALK外显子20。ROS1阳性率为2.4%（5/205），5例融合基因均发生在第34号外显子上，1例同时发生EGFR突变。RET阳性率为3.4%（7/205），7例融合类型均为KIF5B外显子15；RET外显子12，1例同时发生HER2突变。ALK、ROS1、RET融合基因总阳性率更容易发生在无吸烟史（P＝0.017）、实性为主型和浸润性黏液腺癌中（P＝0.012），与病理组织类型（P＝0.390）、性别（P＝0.814）、年龄（P＝0.364）和病理分期（P＝0.179）无关，在腺癌中，EML4-ALK、ROS1、RET融合基因总阳性率发生在EGFR野生型患者中比例为27.4%。EML4-ALK重排更容易发生在病理分期较早和实性为主型和浸润性黏液腺癌中（分别为P＝0.025，P＝0.014），在女性、年轻、不吸烟腺癌突变率更高，但差异无统计学意义。在浸润性黏液腺癌ROS1突变率更高（P＝0.049），在年轻、不吸烟且病理分期晚（Ⅲ期和Ⅳ期）的腺癌患者中较高，但差异无统计学意义。RET重排均为无吸烟史患者，与其他病理特征无关。

6.HER2、NRAS与BRAF突变的特点：

本组患者中HER2、NRAS和BRAF突变率分别为1.5%（3/205）、0.5%（1/205）、0.5%（1/205），均为腺癌不吸烟患者，其中1例患者HER2突变合并RET重排，1例BRAF突变合并EGFR突变。

讨论

在西方国家，55%以上患者至少含有一个基因突变可能适合特定的干预治疗[3]。我们检测到福建地区肺腺癌常见9种驱动基因总突变率为81.7%，鳞癌总突变率为13.3%，与Wang等[4]的研究结果一致，他们的研究显示肺腺癌驱动基因总突变率大于82.7%，肺鳞癌驱动基因总突变率大于13%。本研究未包含AKT、FGFR、DDR2等其他未知的驱动基因，提示肺腺癌、鳞癌驱动基因总突变率可能更高。

有研究表明东亚人群EGFR突变率为30%～50%，本组NSCLC患者EGFR突变率（54.2%）高于其他学者的研究，可能是本研究中腺癌患者比率高（82.4%）的缘故。本组肺腺癌EGFR突变率63.3%，与国内研究相似[5,6]，与Wang等[4]的研究结果相同，他们的研究显示肺腺癌EGFR突变率为63.1%。205例NSCLC组织中EGFR突变率在女性、非吸烟和腺癌患者中较高，与既往的研究结果相符[7]，此外我们发现EGFR突变更容易发生于≥62岁患者，与研究[9]结论一致。EGFR突变与病理分期的关系，不同文献中并无统一结论[6,8]。具有明确分期189例NSCLC组织中，EGFR突变与TNM分期无关，与文献[7,8]结论一致。具有明确组织分型的154例腺癌中，EGFR突变率在鳞屑样为主型、腺泡样为主型、乳头状为主型、微小乳头状为主型腺癌明显高于实性为主型和浸润性黏液腺癌，与Li等[8]研究结果一致。

KRAS突变率在白种人肺腺癌大约20%～25%[2]。KRAS突变东亚人发生率较低，KRAS突变多见于肺腺癌，本研究腺癌KRAS突变率为5.9%，与Wang等[4]的研究结果相符。KRAS突变通常与其他驱动基因包括EGFR、BRAF、HER2突变和ALK、ROS1重排相互排斥，但我们发现1例同时发生KRAS和EGFR突变，1例同时发生KRAS、EGFR和PIK3CA 3种基因突变，因此我们认为KRAS与其他驱动基因并非完全排斥，只是概率很低。本组腺癌的KRAS突变高于鳞癌，但差异无统计学意义，与文献[5]结论一致。本研究KRAS与病理TNM分期无关，男性KRAS突变率高于女性，

我们研究显示PIK3CA突变可与EGFR等驱动基因同时发生，与吸烟与否、病理分期不相关，男性突变率大于女性但差异无统计学意义，这与既往研究相符[9,10]，但本次实验169例腺癌中，≥62岁患者的PIK3CA突变率更高，差异有统计学意义。PIK3CA主要的突变类型为E545K和H1047R[9]，但我们的研究并未得到相同的结论，本研究PIK3CA突变类型以H1047L和E542K为主，提示中国人群PIK3CA主要突变类型可能与西方不一样。与Li等[8]的肺腺癌PIK3CA突变与组织亚型无关的结论不同，本组PIK3CA突变率在浸润性黏液腺癌、胎儿型腺癌更高并且差异有统计学意义。

ALK、ROS1、RET融合基因总阳性率更容易发生在实性为主型和浸润性黏液腺癌中，与文献[11]结论相似。EML4-ALK重排与性别、年龄、吸烟史、组织学类型等病理特征的关系，不同文献中并无统一结论[11,12,13]。本组EML4-ALK重排更容易发生在女性、

综上所述，我们认为有选择地对腺癌、女性和无吸烟史患者进行多种驱动基因检测可提高检出率，为患者靶向治疗提供更多的选择。因本组病例数量较少，鳞癌、腺鳞癌等驱动基因突变率有待大样本资料进一步研究。

参考文献

[1]SiegelRL, MillerKD, JemalA.Cancer statistics, [J]. CA Cancer J Clin, , 65（1）：5-29. DOI:10.3322/caac.21254.

[2]KrisMG, JohnsonBE, BerryLD, et al. Using multiplexed assays of oncogenic drivers in lung cancers to select targeted drugs[J]. JAMA, , 311（19）：1998-. DOI:10.1001/jama..3741.

[3]Clinical Lung Cancer Genome Project （CLCGP）； Network Genomic Medicine （NGM）。 A genomics-based classification of human lung tumors[J]. Sci Transl Med, , 5（209）：209ra153. DOI:10.1126/scitranslmed.3006802.

[4]WangR, ZhangY, PanY, et al. Comprehensive investigation of oncogenic driver mutations in Chinese non-small cell lung cancer patients[J]. Oncotarget, , 6（33）：34300-34308. DOI:10.18632/oncotarget.5549.

[5]凌云，邱田，李卓，等。非小细胞肺癌中EGFR和KRAS基因突变的特点及与临床病理特征的关系[J].临床与实验病理学杂志，，31（5）：536-541. DOI:10.13315/ki.cjcep..05.013.

[6]周建娅，莫伟芳，赵菁，等。非小细胞肺癌患者EGFR基因突变的临床病理特征[J].中华医学杂志，，94（30）：2332-2336. DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491..30.004.

[7]范苗静，李海刚，吕志强，等。表皮生长因子受体基因突变与非小细胞肺癌临床病理特征及预后的关系[J].中华病理学杂志，，40（10）：679-682. DOI:10.3760/cma.j.issn.0529-5807..10.009.

[8]LiH, PanY, LiY, et al.Frequency of well-identified oncogenic driver mutations in lung adenocarcinoma of smokers varies withhistological subtypes and graduated smoking dose[J]. Lung Cancer, , 79（1）：8-13. DOI:10.1016/j.lungcan..09.018.

[9]ChaftJE, ArcilaME, PaikPK, et al.Coexistence of PIK3CA and other oncogene mutations in lung adenocarcinoma-rationale for comprehensive mutation profiling[J]. Mol Cancer Ther, , 11（2）：485-491. DOI:10.1158/1535-7163.MCT-11-0692.

[10]WangL, HuH, PanY, et al. PIK3CA mutations frequently coexist with EGFR/KRAS mutations in non-small cell lung cancer and suggest poor prognosis in EGFR/KRAS wildtype subgroup[J]. PLoS One, , 9（2）：e88291. DOI:10.1371/journal.pone.0088291.

[11]PanY, ZhangY, LiY, et al. ALK, ROS1 and RET fusions in 1139 lung adenocarcinomas: a comprehensive study of common and fusionpattern-specific clinicopathologic, histologic and cytologic features[J]. Lung Cancer, , 84（2）：121-126. DOI:10.1016/j.lungcan..02.007.

[12]QuY, CheN, ZhaoD, et al.The clinicopathological significance of ALK rearrangements and KRAS and EGFR mutations in primarypulmonary mucinous adenocarcinoma[J]. Tumour Biol, , 36（8）：6417-6424. DOI:10.1007/s13277-015-3331-4.

[13]钟山，张海萍，郑捷，等。非小细胞肺癌患者EML4-ALK融合基因检测及其与临床病理特征的关系[J].中华病理学杂志，，42（4）：252-256. DOI:10.3760/cma.j.issn.0529-5807..04.009.

[14]程弘夏，叶伦，薛力泉。荧光原位杂交法检测非小细胞肺癌患者ROS1基因重排及其与临床病理特征的关系[J].中华肿瘤杂志，，36（10）：751-754. DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-3766..10.006.

[15]CaiW, SuC, LiX, et al. KIF5B-RET fusions in Chinese patients with non-small cell lung cancer[J]. Cancer, , 119（8）：1486-1494. DOI:10.1002/cncr.27940.

如果觉得《非小细胞肺癌驱动基因突变与临床病理特征的关系》对你有帮助，请点赞、收藏，并留下你的观点哦！