（一）免疫组化（IHC）
简介：
免疫组化，具体的原理在此不再赘述（公众号后续会对各实验原理进行详细的解读）。简而言之，它是应用免疫学基本的抗原抗体反应原理，即抗原与抗体特异性结合（利用该原理的实验技术是生命科学研究中最经典最实用的实验技术，包括下面提到的免疫荧光（IF）/免疫印迹（WB）/免疫沉淀（IP）等），通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC)。对于免疫组化技术，其实验过程中涉及众多的环节，包括烤片脱蜡、抗原修复、通透固定、染色孵育等，这些环节又会涉及到不同的试剂方法和处理条件的选用，后续我们会针对各实验技术中的某一个或多个具体环节进行方法学比较阐述。在此，仅示以最通用的实验流程，具体环节可自行根据经验调整或留言共同探讨。
流程：
1、将标本在60℃烘箱中放置20 min进行脱蜡：分别用100%二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡15 min；
2、梯度酒精水化：100%→100%→90%→80%→70%，各5min；
3、三蒸水冲洗2次各5min；
4、去内源性过氧化物酶 7ml 30%过氧化氢中，加入63ml甲醇，37℃，避光水浴15min；
5、PBS洗5min×3次；
6、4 ml EDTA + 196 ml 三蒸水，在微波炉中加热；高温煮沸后中低火持续10 min，冷却至室温，PBS洗5min×3次；
7、羊血清工作液室温封闭2 h；
8、吸去封闭液，加入PBS稀释的一抗，置于湿盒中，4℃过夜（16 h）；
9、PBS洗5min×4次；
10、加入HRP标记的二抗（1:1000稀释于0.1%BSA/PBS），37℃ 1 h；
11、PBS洗5min×3次；
12、DAB显色，1ml双蒸水+A液、B液、C液各1滴，室温下显色，镜下观察决定是否中止显色，时间不定，一般＜5 min；
13、苏木素复染，时间不定，观察颜色深浅而定，约40 s ；
14、自来水冲洗10 min，1%HCl洗2-3次，自来水冲洗20 min；
15、梯度脱水透明（封片）：酒精70% →80%→90%→100%→100%各5min→二甲苯10 min×2次；
18、中性树脂封片，室温下晾干；
19、观察，阳性结果呈棕黄色。
（二）免疫荧光（IF）
免疫荧光（Immunofluorescence，IF）又称荧光抗体技术，与上述免疫组化相似，也一种标记免疫技术，而且是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。根据标记抗体的不同，可分为直接免疫荧光（一抗荧光直标）和间接免疫荧光（二抗荧光标记）。除了涉及到上述免疫组化中相关环节外，最重要的还有荧光相关的环节，包括背景问题、自发荧光问题、荧光素选择问题、荧光显微镜相关问题等，同样，后续我们会针对该实验技术中的某一个或多个具体环节进行方法学比较阐述。在此，仅示以最通用的实验流程，具体环节可自行根据经验调整或留言共同探讨。
A.石蜡切片IF：
1、将标本在60℃烘箱中放置20 min进行脱蜡：分别用100%二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各浸泡5min；
2、梯度酒精水化：100%→100%→90%→80&→70&，各2min；
3、自来水冲洗5 min；
4、柠檬酸抗原修复液煮15 min（92℃--95℃），自然冷却至室温；
5、0.3%过氧化氢的甲醇溶液浸泡15min，自来水冲洗，PBS浸泡15 min，PBS洗3min×2次；
6、1% BSA室温封闭15min；
7、一抗孵育过夜（4℃，8—16 h）；
8、PBS洗3min×4次；
9、加荧光标记的二抗，避光，37℃，1 h，或室温2 h；
10、PBS洗3min×4次；
11、封闭剂封片。
B.细胞爬片IF：
1、预冷PBS洗3次，每次5min；
2、4%多聚甲醛，室温固定20min；
3、预冷PBS洗3次，每次5min，（可4℃保存）；
4、0.2% Triton X-100破细胞膜5min；
5、预冷PBS洗3次，每次5min；
6、1%BSA封闭1h；
7、加一抗（PBS稀释），4℃过夜；一般加约20 μl，置于湿盒中；PBS组作为空白对照，检测二抗的非特异性结合；
8、取出玻片，预冷PBS洗3次，每次5min；
9、加二抗，37℃，避光1.5 h，置于湿盒中；
10、预冷PBS洗3次，每次5min；
11、DAPI染核，室温2h。
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