论著 |SKOV3 MRTFA在卵巢癌中的表达及其对肿瘤细胞增殖 侵袭能力的影响

袁爱娟，钱红飞，杨玮丽，叶优春

宁波市鄞州人民医院妇产科 315040

通信作者：袁爱娟，Email：doctor_9@,电话:13957494424

[摘要] 目的探讨SKOV3、MRTFA在卵巢癌中的表达变化及其对肿瘤细胞增殖、侵袭能力的影响。方法将6月至5月宁波市鄞州人民医院收治的91例卵巢癌患者作为观察对象，对卵巢癌组织内MRTFA mRNA相对表达量和临床特征关系进行分析；对卵巢癌SKOV3细胞进行培养，分为MRTFA干扰组、阴性对照组和对照组（各组具体处理因素要列出），经Transwell法测定SKOV3细胞侵袭能力，通过Western-blot法测定SKOV3细胞内MRTFA蛋白表达。结果卵巢癌组织、癌旁组织内MRTFA mRNA相对表达量分别是（1.92±0.09）、（1.08±0.14），卵巢癌组织内MRTFA mRNA相对表达量显着高于癌旁组织差异有统计学意义（t=48.146,P=0.00）；肿瘤直径＜10 cm、FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移的卵巢癌患者卵巢癌组织内MRTFA mRNA相对表达量分别低于肿瘤直径≥10 cm、低分化、FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期及淋巴结转移卵巢癌患者（P＜0.05）。MRTFA 干扰组卵巢癌SKOV3细胞培养24 、48 、72 及96 h后吸光度值均低于对照组及阴性对照组（P＜0.05）; MRTFA干扰组的卵巢癌SK0V3细胞培养24h后侵袭细胞数（86.72±4.69）低于阴性对照组（121.89±3.65）和对照组（117.10±4.41），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论MRTFA在卵巢癌中表达异常增高，对MRTFA蛋白表达进行特异性抑制，能阻断SKOV3细胞增殖及侵袭，其作用机制可能和SRF蛋白诱导上皮间充质的转化过程存在相关性。

[关键词]心肌素相关转录因子A；卵巢癌；SKOV3；增殖；侵袭

基金项目：浙江省卫生厅（RC274）

卵巢癌作为常见、高发性女性生殖系统恶性肿瘤，因遗传因素、内分泌因素等相关因素影响，卵巢癌的患病率显着增高，并伴年轻化趋势[1]。相关研究显示，卵巢癌相关肿瘤细胞的高侵袭性、转移性为干扰患者预后的重要因素[2]。心肌素相关转录因子A（myocardin-related transcription factor A, MRTFA）作为血清应答因子主要辅助因子，参与SRF介导性生理功能，且参与肿瘤细胞侵袭、转移过程[3-4]。SKOV3细胞作为常见的卵巢癌细胞，具有良好的细胞增殖、分化潜能，如不进行干预，肿瘤细胞可不断增殖、分化成软骨细胞，侵袭健康器官组织，故阻断卵巢癌细胞SKOV3的体外增殖、分化侵袭就显得尤为重要，对于临床控制卵巢癌病情进展具有积极意义[5-6]。基于此，本研究对MRTFA在卵巢癌中的表达变化及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭能力的影响进行探究。

1 资料与方法1.1一般资料

选取6月至5月宁波市鄞州人民医院收治的91例卵巢癌患者作为观察对象，平均年龄是（54.13±9.92）岁，范围33～76岁。FIGO（国际妇产科联盟）分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期17例，Ⅲ期48例，Ⅳ期6例；组织学类型：浆液性53例，非浆液性38例；组织分化程度：高分化16例，中分化27例，低分化48例；是否转移：伴淋巴结转移41例，无淋巴结转移50例。纳入标准：入选患者均通过临床影像学、手术病理检查明确是卵巢癌[7]；均经手术获取卵巢癌病理组织标本，并经液氮速冻，置入-70℃冷冻环境下冻存；术前未接受放疗、化疗治疗；患者均知情，签署相关同意书。排除标准：伴精神疾病、血液系统疾病、感染性疾病及传染性疾病者；伴其他恶性肿瘤者；妊娠期、哺乳期妇女；伴严重肝肾功能减退及肺功能障碍、心功能不全者。本研究符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 方法1.2.1 材料与仪器

标本收集采集6月至5月本院收治的91例卵巢癌患者的肿瘤病理组织标本、癌旁组织标本，并经液氮速冻，置入-70℃冷冻环境下冻存，备用。

主要仪器紫外分光光度计，购自重庆光学仪器厂；台式离心机（LX3-II），上海医用仪器厂；电热恒温水浴锅（DK-S26），购自上海精宏实验设备公司；全自动生化分析仪，购自美国麦克公司；PCR仪（PC-808），购自日本ASTEC公司；Real-time PCR仪（7300），购自美国应用生物系统公司；AB SCIEX QTRAP 6500液-质联用仪，购自美国AB SCIEX公司；TGL-16C高速离心机，购自湖南星科科学仪器有限公司。

1.2.2 MRTFA mRNA表达测定

将手术采集的卵巢癌患者肿瘤病理组织标本、癌旁组织标本进行碎化处理后研磨，加入细胞裂解液；提取肿瘤细胞组织的RNA，所有操作完全按照RNA提取试剂盒携带说明书进行。成功提取肿瘤组织RNA后，采用紫外分光光度计检测所提取RNA纯度。同时，利于试剂将RNA合成为cDNA，置于Real-time PCR仪（7300）中扩增引物。设置反应条件是：95℃、94℃、58℃、72℃条件下分别反应180s、30s、30s、30s，循环38次后实时计算卵巢癌组织、癌旁组织内的MRTFA mRNA相对表达量。

1.2.3 细胞培养和分组

将采集的肿瘤SKOV3细胞置于培养基，在适度环境（37℃、5%CO2）中进行培养，通过胰蛋白酶进行消化传代。根据转染序列的不同进行分组：对照组未接受任何处理，转染阴性对照组的序列是5´-AUGUUUGCCAUGAGUAUUA-3´，MRTFA干扰组的转染序列是5´-GUGCGUGCAUAUCAAGAACAA-3´。

1.2.4 SKOV3细胞侵袭能力测定

选择Matrigel基质胶，通过培养基（内无胎牛血清）根据9:1比例稀释，于37℃环境中凝固。与此同时，在转染细胞培养48 h后取出，胰蛋白酶消化后将调整细胞密度为4×105/ml；然后取出含20%胎牛血清的培养液置于37℃环境中培养48 h，取出后用甲醛固定，通过电子显微镜进行拍照，对穿膜细胞数进行计数。

1.2.5 Western-blot法测定肿瘤细胞的MRTFA、SRF蛋白表达

取采集的肿瘤细胞，经转染培养后进行电泳试验，分离蛋白组织。在经过4次TBST冲洗后放置于室温环境封闭（5%脱脂奶粉），再加入兔抗人SRF（稀释比例是1:800）和一抗MRTFA抗体（稀释比例是1:400），放置于适度环境（4℃）下进行孵育，孵育成功后加入二抗反应60min，加入发光试剂反应，最后通过Image J软件分析条带对肿瘤细胞的MRTFA、SRF蛋白表达进行分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件行数据校对，计量数据用

表示，行t检验；组间对比用方差F值分析，多组间两两比较彩用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 卵巢癌组织、癌旁组织内MRTFA mRNA的相对表达量

卵巢癌组织、癌旁组织内MRTFA mRNA相对表达量分别是（1.92±0.09）、（1.08±0.14），卵巢癌组织内MRTFA mRNA相对表达量显着高于癌旁组织（t=48.146，P=0.000）。

2.2 MRTFA mRNA表达和临床特征关系

肿瘤直径＜10cm、FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移的卵巢癌患者卵巢癌组织内MRTFA mRNA相对表达量低于肿瘤直径≥10 cm、FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移的卵巢癌患者（P＜0.05）（表1）。

2.3 SKOV3细胞增殖活性

MRTFA 干扰组卵巢癌SKOV3细胞培养24 、48、72及96 h后吸光度值均低于对照组和阴性对照组（P＜0.05）（表2）。

2.4 SKOV3细胞侵袭能力

卵巢癌SKOV3细胞转染培养24h后，对照组卵巢癌SKOV3细胞侵袭细胞数117.10±4.41，阴性对照组卵巢癌SKOV3细胞侵袭细胞数121.89±3.65，MRTFA 干扰组卵巢癌SKOV3细胞侵袭细胞数86.72±4.69；对照组、阴性对照组的卵巢癌SKOV3细胞培养24 h后侵袭细胞数高于MRTFA 干扰组（P＜0.05）（表3）。

2.5 MRTF、SRF蛋白相对表达量

对照组、阴性对照组卵巢癌SKOV3细胞内MRTF、SRF蛋白表达量高于MRTFA 干扰组（P＜0.05）；对照组卵巢癌SKOV3细胞内MRTFA、SRF蛋白相对表达量和阴性对照组对比差异无统计学意义（P＞0.05）（表4)。

3 讨论

卵巢癌是危害女性生命健康的常见恶性肿瘤，患病率仅次于子宫颈癌，多表现为上皮癌，其次为恶性生殖细胞肿瘤，对女性生命健康存在严重危害[8]。卵巢癌晚期可侵犯、压迫患者的盆腔脏器，并伴随有腹腔种植的倾向，诱发腹水症状。与此同时，卵巢癌进展可影响患者的黏膜和腺体等器官，形成众多不规则形状的恶性肿块，无包膜且与肿瘤细胞周围组织的分界不清，表面常伴有坏死及溃疡现象[9]。目前，临床针对卵巢癌的发病机制尚未彻底阐明，患者缺乏特异性临床表现，于确诊时多数患者已进展到晚期，治疗效果及预后不理想，具有较高的复发率[10]。积极探索生物学标志物实施诊断、明确高效的基因治疗靶点为临床研究热点、难点。相关研究发现，肿瘤细胞的高度迁移性、侵袭性为引起卵巢癌复发的主要原因[11]。血清SRF作为细胞的转录因子，在肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡过程中起到重要作用，其在众多恶性肿瘤组织内呈高表达，和肿瘤细胞侵袭、转移存在相关性[12]。MRTFA作为SRF主要辅助因子，属于SAP蛋白家族，在调控SRF转录过程意义重大，和卵巢癌细胞增殖及分化、迁移具有密切相关性。同时，SRF作为肿瘤细胞转录因子，在卵巢癌、胃癌和大肠癌等相关恶性肿瘤组织内表达异常增高，参与肿瘤进程[13-14]。

本研究显示，肿瘤直径＜10cm、FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期、中高分化卵巢癌组织内MRTFA mRNA相对表达量低于肿瘤直径≥10cm、FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期、低分化卵巢癌患者，说明MRTFA基因在卵巢进展过程中可能发挥作用，监测MRTFA基因相对表达量，能为临床诊断卵巢癌及判定病情进展提供指导[15]。同时，本研究通过siRNA技术对卵巢癌SKOV3细胞内MRTFA相对表达进行特异性抑制，经Western-blot法检测发现，MRTFA干扰组的卵巢癌SKOV3细胞内MRTFA蛋白相对表达量明显低于对照组和阴性对照组，说明卵巢癌SKOV3细胞内MRTFA基因表达成功被抑制[16-17]。本研究表明，MRTFA 干扰组卵巢癌SKOV3细胞培养24、48、72及96 h后吸光度值均低于对照组和阴性对照组，提示对卵巢癌SKOV3细胞内MRTFA基因表达实施特异性抑制，能对卵巢癌SKOV3细胞增殖活性进行有效抑制，说明MRTFA基因在卵巢癌SKOV3细胞增殖过程中可能发挥作用。对照组和阴性对照组的卵巢癌SKOV3细胞培养24 h后侵袭细胞数均高于MRTFA 干扰组，提示对卵巢癌SKOV3细胞内MRTFA基因表达进行特异性抑制，能使卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力降低。研究数据表明，卵巢癌SKOV3细胞内MRTFA、SRF蛋白相对表达量更高，提示对卵巢癌SKOV3细胞内MRTFA基因表达进行特异性抑制，说明MRTFA通过SRF蛋白介导EMT，在卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭过程中发挥作用[18]。

综上所述，MRTFA在卵巢癌进展过程中异常增高，SKOV3、MRTFA蛋白与卵巢癌进展程度具有密切相关性，可作为卵巢癌临床诊治预后及评估的新靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献略

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