最近几年，植物化学这门学科已发展成为天然产物有机化学和植物生物化学之间的一门专门学科，并且同这两方面紧密关联。植物化学涉及大量的由植物精制和积累起来的各种各样的有机物质，它研究这些物质的化学结构、合成、转化和代谢、天然分布及其生物学功能。 所有这些工作，均需要分离、纯化和鉴定植物中存在的许多不同成分的方法。因而，我们所了解的植物化学的进展，是与已有技术的成功开发，以及不断发展解决植物化学中出现的突出问题的新技术直接相关。植物化学的挑战之一是用极少的材料进行上述所有操作所有操作。生物学问题，譬如植物生长调节作用、植物—动物相互作用的生物化学、或者了解化石植物的起源等问题的解决，常常取决于鉴定一系列只能用微克量级研究的复杂的化学结构。 本书的目的是首次提供目前可以利用的植物物质的分析方法入门，提供有关该学科文献的一把钥匙。这里所叙述的方法并无新奇之处。实际上，其目的是概述已经最广泛采用的那些方法，这样，学生和研究工作者可以最快地发展自己的技术，以解决自己的问题。 我们采用一些简单的化学实验室技术训练作基础，因为许多技术简单而又明了，对于化学知识很少的植物学家和其他植物科学家来说，是能够从事植物化学工作的。从事其它实际课题的研究时，学生们必须发展自己的经验。没有什么准确地写下来的处方，可以代替平时实验室的常识和由基本原理进行思考的能力。随后的大部分章节提供一些实际的实验例子，通过这些实验可以获得工作经验。它们适于作为实验课程，许多方法早已用于此目的。 植物产生的各种分子结构的范围和数目是巨大的，我们现有的有关植物成分的知识进展是如此之快，以致植物化学研究的一个主要问题是核对有关每一类特殊化合物的资料。例如，曾经估计过，目前已知有5500种以上的植物生物碱。由于医药上对新奇生物碱的兴趣如此之大，以致于这种新生物碱可能正以每天一个的速度被发现和描述。
由于已知物质的数目是相当之大，因此在本书的每一章中均作了专门介绍，指出在每类化合物之内存在的结构的多样化，扼要说明那些普遍存在的化合物并说明具有代表性的分子式的化学多样性。尽可能列出每类已知化合物的最新文献，包括大多数最普遍的植物成分的RF值、显色反应以及特殊性质的表。这些表主要是说明性的或作比较之用，并不详尽。
从植物中筛选化学物质的快速而精密的方法的发展，大大有助于植物化学的进展。因此本的侧重点放在层析技术上。这些方法已经表明，许多原来认为相当稀有的物质，在植物界却几乎普遍存在。植物的生物学活性物质的连续调查的重要性无需强调。当然，在随后的各章中相当详细地讨论特殊化合物类的初步检测方法。
虽然“植物”一词在这里指的是植物界这个整体，但侧重于高等植物，而对微生物的分析方法不详细讨论。作为一般的原则，鉴定高等植物中的生物碱、氨基酸、醌类和萜类所用的方法亦可直接用于微生物系统。在许多情况下，分离要容易得多，因为通常不存在诸如单宁和叶绿色这样的杂质。在少数情况下，分离可能比较困难，由于微生物细胞有弹性因而需要采用机械破碎以释放出存在的某些物质。
由于篇幅的限制，有许多在微生物中发现的有机化合物如青霉素（Penicillin）和四环素（tetracycline）抗菌素（Turner，1971；Turner和Aldridge，1983），它们的鉴定不包括在内。地衣类亦制造一系列特殊的色素，包括缩酚酸环醚和缩酚（羧）酸类。这些化合物根据其显色反应，层析和光谱技术等特殊的微量化学方法进行分析。Culberson（1969）对地衣化学做出了全面的阐明。地衣色素在第二章中将简单地叙述。
植物的化学成分可以用许多不同的方法分类。本书是根据生物合成来源、溶解度性质以及存在某些关键的官能团分类。第二张讲述酚型化合物，是一类根据其亲水性以及其共同亲源于芳香族的前体莽草酸(Shikimic acid）而很容易辨认的物质。第三章讨论萜类，它们均具有酯类性质，其生物合成来源为异戊烯焦磷酸（ isopentenyl Pyrophosphate）。第四张专述有
机酸、脂质以及由乙酸酯生物合成而获得的其它化合物。第五章为植物氮的化合物，以对水合茚三酮（ninhydrin）或Dragendorff试剂（将次硝酸铋1.5克悬浮于20ml热水中，加入碘化钾7克及稀盐酸20滴而成）的阳性反应辨认的碱性物质。第六章涉及水溶性碳水化合物及其衍生物。最后，第七章主要包括植物的大分子即核酸、蛋白质和多糖，这些化合物以及高分子量容易同其它成分分开。
在引论这章的其余部分，概括地讨论提取、分离和鉴定的方法。最后一节包括植物化学方法应用于不同植物科学领域的一些例子。
可以利用的有关植物分析方法的主要参考资料为Peach和Tracey(1958-1984)主编的、用英文和德文写作的七卷论文，这部着作现在虽然已显过时，但可供作本学科必要的基础读物。涉及植物化学方法的许多其它教科书，列在本章及以后各章末尾的参考文献中。可以查阅的有关最新技术的杂志《层析杂志》（Journal of Chromatography)，《植物化学》(Phytochemistry)，《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)，《层析科学杂志》(Journal of Chromatographic Science)和《植物学》(Planta)。
1.2 提取和分离
1.2.1 植物材料
最理想的植物材料应采用新鲜的植物组织，且材料应在收集的几分钟内浸入沸乙醇中。有时候，手头没有要研究的植物，材料可能要由住在另一个大陆的收集家供应。在这种情况下，将新鲜采摘的组织干藏在塑料袋中，在几天的航空邮寄的时间内，通产能保持良好的分析条件。
或者，可在提取之前将植物干燥。干燥操作必须在控制的条件下进行，以避免太多的化学变化发生。应尽早可能快地干燥，不用高温，可用一台质量好的风干机风干。植物一旦完全干燥之后，即可在分析之前长时间储藏。确实，许多年前曾成功地用标本的植物组织进行类黄酮、生物碱、醌类和萜类的分析。
利用标本材料的一个例子是精油的分析，其材料是薄荷叶的模式标本，它是1800年前林奈（Linneaus）的原始采集获得的(Harley 和Bell，1967）。在叶和果实组织中，精油的含量可能随时间发生变化，这种可能性必须考虑到。例如，Sanford和Heing（1971）发现，肉豆蔻果中的肉豆蔻醚（myristicin）的含量在储藏时慢慢地增加，而挥发性较大的β-蒎烯（β-Pinene）的含量却随时间的推移而降低。另一方面，虽然时间推移，植物标本中的类黄酮和生物碱却相当稳定，如原来在1675年采集的马钱子（Strychnos nuxvomica）的叶样品仍含有1-2%重量的生物碱（Phillipson，1982）。
显而易见，必须注意把所研究的植物组织同其它混杂的植物分开。例如，要采用无病的植物，即不受病毒、微生物或真菌感染影响的植物。因为在这样的植物中，不仅可能检出微生物的合成产物，而且感染还可能严重地改变植物的代谢，可能大量地产生预料不到的产物。
在收集低等植物材料做分析时，亦能产生混杂现象。采集寄生在树上的真菌时，重要的是除去样品中的所有树木组织。由于污染的缘故，早期有关两种真菌中绿原酸(Chlorogenic acid）（一种典型的高等植物产物）的报告几乎可以肯定是不正确的（Paris等，1950）。在小心弄干净后的材料商做重复分析并没有显示该化合物存在的证据(Harbone，J.B.和Hora，F.B.，未发表的结果）。苔藓类（mosses)常常与高等植物紧密结合生长，因此，要得到没有枯枝层混杂的苔藓有时是件难事。最后，可能被不正确地认为是同一种，或者可能采集了一种植物而没有觉察到有一种寄生物（诸如菟丝子，Cuscuta epithimum）与它纠缠在一起。
在植物化学分析中，所研究的植物学鉴定，必须由其中某一研究时期所公认的权威确证。过去在植物鉴定方面出了这么多的错误，所以无论报道植物的新物质，还是报道新植物来源的已知物质，必不可少的是确证其材料。材料的鉴定应当是无可争辩的（例如由一个野外工作的植物学家在预期的生境采集的一个普通种），或者应尽可能由分类学家证实其鉴定。为此，目前植物化学研究中的普遍惯例是在一个公认的植物标本室，存放所研究的经证实的植物标本，以便将来需要时，作为研究该植物的进一步参考。
1.2.2 提取
正确的提取方法自然取决于被提取的植物材料的构成和含水量，取决于被分离的物质的类型。一般地说，需要把植物组织“杀死”，即防止酶的氧化作用或水解作用发生。把新鲜的叶或花组织（有必要时适当地切碎）投入沸乙醇中是达到这个目的的好方法。总之，任何情况下乙醇用于初步提取是一种良好的全效型溶剂。随后，将材料置于捣碎器中浸解并过滤；但这种方法只有打算完全提取时才有必要。从绿色组织分离物质时，醇提取的成效与进入溶剂的叶绿素的量直接相关。当反复提取至组织碎片无绿色时，可以认为，所有低分子量的化合物都已提取完毕。
从植物干组织（心材、干种子、根、叶）获得有机成分的经典化学方法是，在索氏提取器中，用一系列溶剂连续提取经粉碎了的材料；开始一次用乙醚、石油醚和氯仿提取（分离脂肪和萜类），然后用乙醇和乙酸乙酯提取（极性较大的化合物）。在克量级操作时，此方法是有用的；但是，人们很少达到成分的完全分离，同样的成分可见于（不同比例）几种不同溶剂提取的组分中。
将提取液通过硅藻土，用水泵抽滤净化，然后真空浓缩。现在常用旋转蒸发器进行浓缩，它能在不太强烈的条件（即在30℃-40℃温度）下，把大体积的溶液浓缩为小体积。从植物中提取挥发性成分要特别小心，这些将在第三章讨论。
人们通过实践，可以简化提取步骤。例如，从叶组织中分离水溶性组分时，严格地说，应在浓缩前用石油醚反复洗涤水提取物以除去其中的脂类化合物。实际上，将乙醇提取液直接在旋转蒸发器中浓缩时，几乎所有的叶绿素和脂类物质均沉积在烧瓶的壁上。在熟练时，浓缩恰到好处，这时用导管吸出水浓缩液，则几乎可完全地除去脂类杂质。
浓缩后的提取液放置时可能吸出结晶，如是，过滤收集结晶，并用几种溶剂进行层析检验其均一性（见下一节）
如果为单一物质，则此结晶经重结晶纯化，即可用于进一步分析。在大多数情况下，结晶中可能存在一些物质的混合物，这样就有必要把它们重新溶于一种适当的容积，用层析法将其成分分开。在结晶母液中亦保留许多化合物，这些化合物亦应层析分类。预防物质损失的一个标准方法是将浓缩过的提取液储藏在冰箱中，并加入痕量的甲苯以防止霉菌生长。
研究一个指标的植物种的植物化学全貌时，粗提取物的分部是必要的，以便在层析前将主要几类成分彼此分开。图1-1中所示是根据成分的极性不同分离的一个程序，它可应用于含生物碱的植物的成分分离。当然，分离到不同部分中的化合物的数量与类型，将因植物不同而异。还有，当研究不稳定物质时，这程序可能要做些变动。
1.3分离方法
1.3.1一般方法
植物成分的分离和提纯主要是采用四种层析技术即纸层析、薄层层析、气液色谱和高效液相色谱中的一种或结合进行的。技术的选择大大地依赖于被分离的化合物的溶解性和挥发性。纸层析法特别可用于水溶性的植物成分，及碳水化合物、氨基酸、核酸碱基、有机酸及酚型化合物。薄层层析是分离所有脂溶性化合物（即脂类、甾族化合物、类胡萝卜素、简单的醌和叶绿素）所选用的方法。相反，第三种技术即气液色谱主要应用于分离挥发性化合物——脂肪酸、单萜和倍半萜类、烃类及硫的化合物。但是，把高沸点的植物成分转化为酯和三甲基硅醚可以增进其发挥性，因此没有几类化合物是完全不适合气液层析分离的。挥发性低的成分还可以用高效液相色谱分离，这是一种兼具柱效率和分析速度的分离方法。此外还应指出，可以适当地交叉使用上述技术，通常是将纸层析与薄层层析、薄层层析与高效液相色谱、或薄层层析与气液色谱结合使用，这可能是分离某类植物成分的最好方法。
上述技术微量和大量均可使用。制备分离时可在一厚度的吸附剂上进行薄层层析，在一张厚滤纸上进行纸层析。要分离更大量的样品时，通常采用配有自动分部收集的柱层析，这种方法能制备克量级的纯化合物。
电泳是植物化学中应用相当广泛的一种更进一步的技术。起初，这种技术只应用于带电荷的化合物，及氨基酸、一些生物碱、胺类、有机酸和蛋白质。但是，还有一些中性化合物（糖类，酚类），转化为金属复合物（例如用Na3BO3）即能在电场中移动。Sargent(1969)对电泳技术做了简单的介绍。
除了已述的技术外，在植物化学研究中，偶尔还采用其它一些技术。用简单的液-液萃取分离，在类胡萝卜素的分离分析方面仍有价值（第3章）。有时也可采用自动的液-液萃取方法，如用Craig所设计的反流分配（逆流分容）装置，但它只是在其它技术失败时，被作为最后的手段。最近已发展了一套更方便的液-液萃取装置，即所谓的点滴反流层析（DCCC），它主要应用于水溶性成分的制备量分离（Hostettmann，1981）。植物蛋白质和核酸的分离常常需要采用这里尚未提到的特殊技术，如Sephadex（葡聚糖）凝胶过滤、亲和层系和差速超离心等等。
因为有关层析法技术已有众多的着述（见Heftmann，1983等），因此在这里仅需讨论一下应用于植物化学研究的那些主要分离技术，并给出一些其它有用教科书的有关的参考文献。
1.3.2纸层析
纸层析的主要优点之一是非常方便，即简单地在滤纸条上进行分离，滤纸既作分离介质，又作载体。另一优点是纸上测定的RF值重现性好，因此它是阐明新的植物化合物的有价值的参数。确实，对于诸如花青苷（anthocyanins）这类无其它明显特征的物理性质的物质，其RF值是描述和鉴别各种不同色素的最重要方法（Harborne，1967）。
纸层析通常包括分配层析和吸附层系。在分配层析中，化合物在水不溶混的醇溶剂（例如正丁醇）和水之间分配。经典的混合溶剂正丁醇-乙酸-水（4：1：5，顶层）（缩写为BAW）被设计作为增加正丁醇层的水含量的一种方法，因而改善了溶剂混合物的利用率。确实，BAW仍广泛作为许多类植物成分的一般溶剂。相反，吸附力是在水性溶剂中纸层析的主要特性之一。纯水是一种值得注意的通用层析溶剂，它一般可用来分离普通的嘌呤类和嘧啶类，亦可应用于酚类和植物糖苷类的分离。
纸层析装置的选择，在某些程度上取决于可利用的实验室空间的大小。例如，水平的或圆形的纸层析所占得空间要比标准的薄层层析槽稍微大些，其分辨率相当高，因而被用来分离类胡萝卜素类化合物。在大多数实验室中，纸层析以下行法进行，槽中滤纸的大小为46×57㎝（Whatman滤纸）。下行法纸层析是最有用的，因为必要时易于让溶剂跑过头。它对双向分离亦较方便些。
一系列重要的“改良的”商品滤纸可用于完成特殊的层析分离。例如将硅胶或氧化铝掺入纸中可以降低纤维素的极性，使滤纸较适合于分离脂类、滤纸也可以在实验室中改良，例如，把它们浸渍在石蜡或硅油中，便可以“逆相”层析分离脂类。大量分离可以用厚层滤纸（Whatman3号或3MM纸），这种滤纸每张可以分离几毫克的物质。
在纸层析中，化合物的检测通常是用一种生色试剂喷雾或浸渍，使之与被检测的化合物反应生成有色的或紫外荧光斑点。大张滤纸，浸渍通常容易些，但其喷雾溶剂量应当改进，以利快干，这样可避免浸渍时的扩散作用。然后可将滤纸加热使之显色。
RF值是一种化合物在层析时相对于溶剂前沿的移动距离。它由以下方法测得：测量原点到该物质产生的斑点中心的距离，此距离除以原点到溶剂前沿的距离（即溶剂移动的距离）。
RF值总是一个分数，其数值在0.01和0.99之间。为方便起见，常将RF值乘以100.本书所引用的RF均为RF（×100）。另外有时把RF（×100）称为hRF值。
比较一系列结构上相关的化合物的RF值时，指定另一个层析参数即RM值是有用的，它和RF的关系用下式表示：
)1R1
log(RFM
此式在表达层析迁移率同化学结构关系方面很有价值，因为在同系列中，△RM值通常是常数。以黄酮类化合物为例，对分子中存在的羟基和糖基取代数目来说，△RM是个常数（BateSmith和Westall，1956）。这一方法可用来计算一系列化合物中的未知成员的RF值，有利于检查植物提取液的特殊化合物。例如，采用这样的方法表征一种新的莰非醇甲醚时，预测的（理论值）和实验的RF值非常一致（表1-1）（Harborne，1969）。
在大量有关纸层析的文献中，Peereboom（1971）所写的介绍性文章对初学者是有用的。Lederer和Lederer（1957），Linskens（1959）及Sherma和Zweig（1971）等人所着有关纸层析的书，是有特殊价值的RF数据来源。
1.3.3 薄层层析 同纸层析相比，薄层层析的特别优点是多用型，速度和灵敏度。多用性是由于纤维素外，还可以把许多不同的吸附剂涂布在玻板上或其它载体上而用于层析。虽然硅胶使用得最广泛，但板层可以由氧化铝、硅藻土、氢氧化钙、离子交换树脂、磷酸镁、聚酰胺、Sephadex（葡聚糖凝胶）、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、以及上述两种或两种以上物质的混合物组成。薄层层析的速度较快是由于涂布在玻板上的吸附剂比较紧密，分离不稳定的化合物时，速度快是个优点。最后，薄层层析的灵敏度较高，必要时可以完成小于微克量物质的分离。
薄层层析原先的缺点之一是吸附剂涂板很费劲。几年前，由于引入自动涂布机而减轻了劳动。尽管如此，仍需小心操作。玻璃板必须小心用丙酮清洗以除去油脂。其次，水调和的硅胶浆（或其它吸附剂）在涂布之前必须剧烈振荡一定的时间间隔（例如90秒）。根据吸附剂的颗粒大小，可能需要添加硫酸钙半水合物（15%）帮助吸附剂粘固在玻板上。最后，将涂布后的板层风干，然后在100-110℃的烘箱中加热活化30分钟。在某些分离中，以加无机盐来（例如加AgNO3进行银化薄层层析）改良吸附剂的性质，最好在涂板时加入。在实验室仍然使用涂布的层析板的另一个原因是可以控制硅胶的湿度，这是一些分析的关键因素。
但是，新近在大多数工作中通常采用厂商生产的预涂板，因为这些板比较一致，因为能提供重现性较好的结果。有一系列的商品板可以使用，以不同的吸附剂涂布在玻板、铝板或塑胶板上。这些板可能含或不含荧光指示剂。含荧光指示剂的板可用于那些能使荧光焠灭的化合物，在254nm的紫外光下照射即可检测。最新类型的薄层层析板是用微粒硅胶涂制的，这种板层的硅胶颗粒与高效液相色谱柱中使用得一样细。这种层析法称为高效薄层层析（HPTLC），用其分离通常比普通的硅胶层更有效和更快速。
已用于薄层层析的溶剂比应用于纸层析的溶剂范围更广泛，而且，一般地说，在一个溶剂系统中采用不同溶剂的精确比例有更大的幅度，但RF值的重现性比纸层析差得多，因此必须有一个或多个的参考化合物作为标准物质。精确测量薄层层析的RF值的条件标准化是可能的，但是，这是一个很烦琐的过程。薄层层析通常在一个有纸衬里的槽中以上行法进行，因此槽内的气相被溶剂相饱和。当层析板需要用溶剂溢流或采用薄层层析-电泳结合时，可采用水平的薄层层析。
薄层层析板上的化合物通常用喷雾法检测。板的面积较小（20×20㎝），使这种方法相对地简单。玻璃板可以用浓硫酸喷雾，这比纸层析优越。浓硫酸是检测甾族化合物和脂质的有效试剂。
制备薄层层析采用厚层吸附剂（厚达1mm）代替薄层吸附剂（0.10-0.25mm）。可用商品板。将已展开的板上的适当位置的吸附剂刮下来，用溶剂（如乙醚）洗涤这些粉末，最后离心除去吸附剂，则可回收已分离的成分。玻板上吸附剂的强度很大，所以一片板能够用一种或几种不同溶剂系统反复展开（两次展开之间要先干燥）。或者可以使用Van Sumere（1969）设计的多次消去（multiple elimination)薄层层析系统。这种系统包括一个复杂分离的适当阶段，用玻璃刀切下一长条涂有吸附剂的长方型玻璃，在两次分离之间，把新鲜的吸附剂喷洒在这块板上。在下述的有关薄层层析的书中，叙述了许多其它改进方法。
有关薄层层析的文献非常庞大。Stahl（1969）编辑的书最具综合性。Truter （1963）编写了一本简单的引论。其它重要的书有Bobbitt（1963）、Kircher（1978）及Touchstone和Dobbins（1978）的着作。
1.3.4 气液色谱法
同纸层析和薄层层析相比，气液色谱所需的装置较高级且昂贵。但在原理上，气液色谱并不比层析方法复杂。
气液色谱的仪器装置有如下四个主要部件：
（1）柱 通常为一根窄长（如3m×1mm）的金属管，完成蛇形以减少空间。柱中充填涂在惰性粉末（如硅藻土、火砖载体W等）上的固定相（如5-15%硅油）。不一定用填充的柱，也可以采用开放的硅胶柱，在这种柱中，固定相是涂在内表面的一层薄膜（毛细管气液色谱）。
（2）加热色谱柱的加热器。必要的话，柱温以一标准的速率从50℃逐渐升高到350℃并保持在高温限的温度上。柱入口的温度单独控制，以便使样品一进入柱即迅速汽化。溶于乙醚或己烷的样品用一支皮下注射器穿过橡皮隔膜注入入口处。
（3）气流由氮气和氩气等惰性载气组成。这些气体以控制的速率通过层析柱，使化合物在柱上分离。
（4）化合物通过柱时，需要检测装置测量。检测常常以火焰电离和电子捕获的原理为基础。前一种方法需要在气体混合物中加入氢气，并在实际的检测其中烧尽。检测器连接一台电位测量记录仪，记录仪以一系列强度不同的峰记录分离的结果（图1.2）。
气液色谱的结果可以用保留体积RV这个术语来表示，RV为从柱上洗脱一个组分所需的载气的体积；或者用保留时间Rt表示，Rt为洗脱样品所需的时间。这些参数几乎总是以一个相对于一种标准化合物的术语（如RRV或RRt）表示。标准化合物可以加到样品提取液中，或者作为溶解样品的溶剂加入。
气相色谱的主要可变量是柱的固定相的性质和操作温度，这两个条件随被分离的化合物的极性和挥发性不同而变化。按常规，许多物质在进行气液色谱测定之前被转化为衍生物（特别是转化为三甲基硅醚），因为这样能在较低的温度下分离。
气液色谱提供有关植物物质的定性和定量数据，因为测量气液色谱轨迹（图1.2）所显示的峰面积与原始混合物中不同组分的浓度直接相关。有两个测量这些峰面积的一般公式：（a）峰高×半峰高处的峰宽=94%的峰面积（这只适应于对称峰；（b）峰面积等于通过折点引切线所围成的三角形面积。峰面积可以自动测量，例如使用电子积分仪测量。
气液色谱仪可以与其它分析系统连接，使被分离的成分进一步进行光谱分析或其他成分。气象色谱仪最常与质谱测定自动连接。色谱-质谱（GS-MS）联用仪近年来已作为所有植物化学分析技术中最重要的技术之一。
虽然有许多有关气液色谱的书和评论文章，但为从事植物化学工作的读者写的却寥寥无几。从实践的观点出发，Simpson（1970）的着作是一本有用的引论性教科书，Burehfield和Storrs（1962）的着作是一本涉及气液色谱的生化应用更专业的参考书。
1.3.5高效液相色谱（HPLC）
高效液相色谱在其灵敏度及一次操作即能提供定性和定量方面类似于气相色谱，差别在于键合到多孔聚合物上的固定相系统装在窄径不锈钢柱中，而液体流动相在相当大的压力下强力通过。高效液相色谱仪比气相色谱仪更贵，主要是需要一个合适的压力泵系统，所有连接必须用螺丝以承受内在的压力。流动相是可混溶的溶剂混合物，其比例或者保持恒定（常液分离），或者利用一个溶剂混合室连续改变其比例（梯度洗脱），用检测器监测从柱中洗脱的化合物，通常测定其紫外光吸收。且配上一台积分仪处理测定的数据，全部操作可通过一台微处理机控制。
高效液相色谱与气液色谱的主要区别在于，前者在正常室温下操作。因此，分离时不会出现化合物热重排的可能性。但是，对于精密分离，控制高效液相色谱柱的温度可能是有益的。因此需要一个恒温控制的夹套。层析柱通常装填颗粒很小的硅胶，硅胶上涂着或键合上固定相。它对杂质中毒特别敏感，因此，在样品注射入柱头之前，将植物提取液提纯和过滤是必需的工作。
高效液相色谱主要用于非挥发性化合物的分析，即高级萜类、所有类型的酚型化合物、生物碱、脂质和糖类。在紫外和可见光谱区可检测的化合物，其工作最佳。图1.3是以高效液相色谱分离黄酮类化合物的一个例子。糖类在紫外光区没有任何吸收，可用折射率检测器，但这是一个低灵敏度的方法。蛋白质的分离已用改良的葡聚糖凝胶，硅胶或离子交换剂柱的高效液相色谱进行。
在最现代化的高效液相色谱分离中采用预装柱，且有许多类型预装柱商品可以使用。但是，利用硅胶微孔颗粒柱（对非极性化合物）或逆相C18键合相柱（对极性化合物）进行大多数分离是可能的（Hamilton和Sewell，1982）。这里有必要提及一个实验细节，即溶剂必须是超纯的，用前必须除气。
高效液相色谱是加入植物化学家工具库最晚的一项层析技术。除了仪器和溶剂的昂贵之外，它是植物成分定量分析的最重要的和通用的方法，不过尚有待证明它也可用于制备量分离。
1.4鉴定方法
1.4.1 一般方法
在鉴定一种刚分离提纯的植物成分时，首先必须确定它是属于哪一类的化合物，然后找出它是这一类中的某一种物质。必须预先小心检查样品的均一性，即在几种薄层层析和（或）纸层析系统中移动均显示单一斑点。从化合物对显色试验的反应、溶解度、RF性质及其紫外光谱的特征，通常能够明显看出化合物的种类。生化试验也是非常宝贵的：糖苷的存在可以用β-葡糖苷酶水解确证，如芥子油糖苷的存在可以用黑芥子硫苷酶（myrosinase）水解确证等等。对于生长调节剂，生物测定是鉴定的一个必不可少的部分。
同一类化合物内的完全鉴定依赖于测量其它性质，并将这些数据与文献中的有关数据加以比较。这些性质包括熔点（固体）、沸点（液体）、旋光度（光化学活性物质）和RF值或RRt值（在标准条件下）。但是，光谱特征可以同等提供有关植物物质的数据，包括紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）和质谱(MS）的测定。已知的植物化合物可以在上述的基础上加以鉴定。应当与可信物质的光谱数据进行直接比较（如可得到）作最后确证。如果无可信物质可以利用，只要仔细与文献数据比较也能鉴定。如果是一种新的化合物，所有上述数据应当足以表征它。但是，对于新的化合物，通过化学讲解或实验室合成该化合物进行确证更好。
用X-射线晶体衍射鉴定新的植物化合物，目前已成为常规方法，只要有足够的物
质且为结晶型就能用这种方法鉴定。对于复杂的萜类化合物，这种方法特别有价值。因此它能以统一操作提供结构和立体化学两方面的信息。
现在，我们简要地评论一下不同的光谱技术以及它们对植物化学鉴定的比较重要性。有关光谱方法的更详细讨论，读者可以参考许多有关分光光度法在有机化学中的应用的书中之任意一本（Brand和Eglinton，1945；Williams和Flenming，1966；Scheinmann，1970，1974）。
1.4.2紫外和可见光谱法
植物成分的吸光光谱可以用自动记录的分光光度计，以很稀的溶液对溶剂空白进行测量。无色的化合物，可在200-400nm范围内进行测量；有色的化合物，其测量范围为200-700nm。记录所获得的吸光光谱的最大值和最小值的波长(nm)，并记录其特殊的最大和最小的吸光光度（或光密度）（图1.4）。只需痕量的物质，因为标准的风光光度的比色池（1×1cm）只能容纳3ml溶液，若使用特殊的比色池，用于分光光度法测定的溶液只需该体积的十分之一。这样的光谱测量在鉴定许多植物成分方面，在提纯植物产物时监测层析柱的洗脱物以及检查植物粗提液中特定类化合物，诸如多炔存在等方面是重要的。
紫外光谱法中广泛采用的溶剂为95%乙醇，因为大多数化合物在乙醇中均有一定的溶解度。应当避免使用市售的无水乙醇，因为它含有残留的苯，在短紫外光区有吸收。其它常用的溶剂有水、甲醇、己烷、石油醚和乙醚。一般应当避免使用氯仿和吡啶这类溶剂，因为它们在200-260nm 区有强吸收；但是，它们非常适合于植物色素注入累活萝卜素的可将光谱的测量。
当物质已分离成结晶化合物，窃分子量已知或可以测定时，波长最大值的强度通常以术语log∈记录，式中∈=A/cl（A=吸光度，c=浓度，克分子/升，l=比色池光径长度，通常为1cm）。对于浓度和分子量未知的化合物，必须采用吸光值。在这种情况下，各个最大值的高度可以进行比较，即将相当的吸光度表示为其最强峰的吸光度的百分数。纯化是光谱研究的一个基本的准备工作，显示特征吸光性质的植物成分应当反复提纯直到这些性质恒定。层析提纯时，滤纸中存在的紫外吸收杂质的吸收，可以制备滤纸的洗脱液（与样品同时制备）作为空白，这样就可以消除其影响。用薄层层析板进行纯化时应采用类似的步骤。
在中性溶液中，或者在不同的pH范围内，或者在特殊的无机盐存在下，进行反复测量，可以大大地增进光谱测量在鉴定方面的利用率。例如，把碱加到酚型化合物的醇溶液中，其光谱特征地移向长波长（红移），其吸光值增强（图1.4）。相反，当碱加到芳香羧酸的中性溶液中其光谱向相反的方向位移，即移向短波长（蓝移）。诸如化学还原（用NaBH4）或酶水解这样的反应，同样可以再记录式分光光度计的比色池中进行，在有规则的时间间隔测量其吸收情况，可探明是否发生了还原或水解作用。
紫外和可见光谱在鉴定未知成分方面的价值，明显地与光谱的相对复杂性及其波长最大值的一般位置有关。如果一种物质在250-260nm区间显示单吸收峰，那么这种物质可能是一系列值得考虑的化合物中的任何一个（例如，一种简单的酚、嘌呤或嘧啶、芳香族氨基酸等等）。但是，如果它在400-500nm区显示三个可以辨别的峰，在其它地方没有什么吸收，那么它无疑是类胡萝卜素。进而，用两三种其它溶剂测量光谱，并将这些光谱与文献数据比较，还可以指出它属于哪一种特殊的类胡萝卜素。
上述情况意味着吸收光谱在植物色素研究中具有特别的价值，这一点对水溶的和脂溶的植物生色物质（表1.2）无疑是真实的。其它显示特征吸收性质的化合物包括不饱和化合物（特别是多炔类）、普通的芳香族化合物（例如羟基肉桂酸）和酮类。完全无紫外吸收也提供某种有用的结构信息，它表明植物提取液的脂溶性部分中存在饱和脂质和烷烃类物质，或指出其水溶性部分中存在有机酸类、脂族氨基酸类或糖类。
由于篇幅限制，本书只列出有限数目的植物成分的光谱特性，这些性质主要以光谱最大值表格形式记录，而在后面几页还包括光谱曲线的一些说明，比较详细的光谱数据表参见许多有关的这类数据的专辑，例如Hershenson（1956，1962，1966）或Lang（1959）编辑的数据资料。Gillam和Stern（1957）以及Williams和Fleming（1966）的着作是适用性强的吸收光谱的引论性教科书。专门论述天然产物光谱的更专深的教科书是Scott（1964）的着作。还有一本Morton（1975）写的生物化学光谱学的综述性论着。
1.4.3 红外光谱法
植物物质的红外谱可用自动记录式红外分光光度计测量，可用溶液（1-5%）的氯仿溶液或四氯化碳溶液，与医用润滑油（nujol oil）研糊，或者用固体，与溴化钾混合。在后一种情况下，在无水条件下将含1mg样品和10-100mg溴化钾的粉剂用模压制成薄片。测量范围为4000-667㎝-1（2.5-15μm），记录一个光谱约需三分钟。用这种方法获得的典型的红外光谱示意图1.5。
在高于1200㎝-1的红外光谱区出现的谱带或峰，是由所研究的分子内的个别键或官能团的振动引起的（表1.3）。在低于1200㎝-1的光谱区出现的谱带是由整个分子的振动引起的，由于其复杂性，该区就是常说的“指纹”区。各条带的强度主观地用简单的尺度记录为强（S）、中等（M）或弱（W）。
许多官能团可以用其特征振动频率（表1.3）鉴定，这使红外光谱成为确认化合物类属的最简单的且常常又是最可靠的方法。此外，在植物化学研究中，红外光谱最常被用作“指纹”设计，把天然产物与合成样品比较（图1.5）。红外光谱的复杂性使之特别适宜于这种目的，这种比较在许多植物成分的完全鉴定中是很重要的。例如，红外光谱已广泛用来鉴定装备量的气液色谱分离的已知香精油成分。
在图1.5中给出利用红外光谱：指纹识别“生物碱的一个说明。采用溴化钾压片方法鉴定烟草的两个痕量成分为哈尔满碱（harmane）和去甲哈尔满碱（norharmane）（Poindexter和Carpenter，1962）。可以看出，两个生物碱的指纹区的一些细节在天然样品中不存在，这可能是由于存在痕量的杂质的结果。还能看到，虽然这两个生物碱在结构方面非常相似（不同的只是，哈尔满碱为去甲哈尔满碱的c-甲基衍生物），用红外光谱可以容易地鉴别它们。
在植物中遇到新的化合物时，红外光谱测定亦有助于结构阐明。虽然在化学结构和红外光谱吸收峰之间有许多已知的联系，然而一个复杂光谱的实际可能是困难的，操作需要许多经验。不过，就某些种类的化合物来说，解释可能是比较简单的事。测量醌类的1800-1650㎝-1之间的羰基频率可以立即明白羰基是否与邻接的羟基螯合。例如，以蒽醌为例，无螯合的醌在1678-1653㎝-1之间有一条谱带；具有一个α-羟基的醌在1675-1647㎝-1和1637-1621㎝-1之间显示两条谱带；具有两个α-羟基的醌在1675-1661㎝-1和1645-1608㎝-1之间有吸收带。
红外光谱数据的来源可以查阅各种目录，例如Hershenson（1959，1964）。有关红外光谱测定的好的引论性评价见Eglinton（1970）。Cross和Jones（1969）的着作是一本通俗、实用的引论性教科书，已出第三版。
1.4.4 质谱法（MS）
稍晚（大约1960年）引入的质谱法革新了天然产物的生物化学研究，并在许多方面减轻了植物化学家的工作。这种技术的价值是：它只需毫克量级的物质，能提供精确的分子量，能产生一个特殊化合物的复杂的特征碎片图谱，利用这种图谱可以鉴定该化合物。
质谱测定大体上由两步组成：降解痕量的有机化合物和按质量大小记录其碎裂图谱。样品蒸发扩散入质谱仪的低压系统，在这里以足够的能量使样品电离，引起化学键断裂，由此产生的带正电荷的离子在磁场中被加速，磁场把离子分散开并测定特定质荷比的离子的相对风度，由此记录的离子丰度对质量的关系图构成质谱图，它是由一系列不同质量单元的强度不同的线条组成（见图1.6）。
在许多情况下，某些母体化合物在气化过程中保存，它将被记录为分子离子峰。然后可以对这个（以及任何别的）特殊离子进行很精确的质量测量（精确到0.0001质量单位）。这种精确度足以指出物质的精确分子式，因此不必再进行常规的元素分析（通常需几毫克的物质）。
不象紫外和红外分光光度计那样可以由植物化学家自己操作，质谱和核磁共振仪器比较昂贵，而且复杂得多，所以一般要由培训过的人员操作。因此植物化学家去供分析的样品然后取回如图1.6所示的图谱。这种技术几乎成功地应用于每一类低分子量的植物成分，甚至已用于肽的分析。那些在质谱仪中蒸发的而挥发性太低的化合物，可以转化为三甲基硅醚、甲酯或类似的衍生物。赤霉素类化合物正是这种方法测定的。质谱法常常与气液层析（色谱）法联用，色谱-质谱联用可同时提供许多结构上复杂的化合物的定性和定律鉴定，这些化合物可能一起存在于某一植物提取液中。
下面一个例子足以说明质谱测量在植物化学研究中的价值。第一个从高等植物中分离出来的天然存在的生长调节剂细胞分裂素-玉米素就是用质谱测定的。Shannon和Letham（1966）测定它的结构为6-（4-羟甲基-反式2-丁烯氨基）嘌呤。质谱测定的结果（图1.6）对其鉴定相当有帮助，因为在219处有一个显着的分子离子峰，确认其分子式为C10H13ON5。碎片m/z202(M-OH)和m/z188(M-CH2OH)揭示伯醇的存在。碎片m/z148指明烷基定位在N-上。最后，从特征的碎片m/z136，135和108（大多数腺嘌呤衍生物所显示的特征碎片）确证腺嘌呤核的结构。
在质谱测定方面，新技术层出不穷。现代化的光谱仪可以配上快原子轰击源（FAB），因而能分析脆弱的或非挥发性的有机化合物，包括盐类和高分子量物质。以前，用质谱法分析植物糖苷，O-糖苷的糖在测定过程中失去而未被检测，但现在用FAB-MS测定，能够得到原始糖苷的分子离子。
新近出版的两篇论文（Waller，1972和Dermer，1980）中有一些质谱数据应用于植物生物化学研究的例子。读者也可以参考本节中已提到过的普通光谱学中有关质谱法的叙述。
1.4.5 核磁共振谱
质子核磁共振谱测定本质上是通过测量有机化合物的氢原子的磁矩以测定其结构的一种方法。在大多数化合物中，氢原子连接到不同的集团上（如-CH2-、-CH3、-CHO、-NH2、-CHOH-等等），质子核磁共振谱记录这些不同环境的氢原子数。但是它不能提供有关分子的碳骨架特征的任何直接信息。这种信息只能通过13C核磁共振谱获得，这一点在后面叙述。
实际上，将物质的样品溶液（溶于惰性溶剂中）置于强磁极之间，其质子按它们在分子内的分子环境发生不同的化学位移。在核磁共振谱仪中以相对于一个标准，通常为四甲基硅（TMS），测量这些质子的化学位移；四甲基硅（烷）是一种惰性化合物，可以加到样品溶液中而不会发生可能的化学反应。
化学位移以δ或τ单位测量。这里τ=10δ，δ=△ν×106/辐射频率。△ν为样品与参比化合物四甲基硅的吸收频率之差，单位为赫兹（Hz）。因为总辐射频率通常为60兆赫兹（60百万赫兹），而位移以赫兹为单位测量，所以位移单位常常称为p.p.m.。另外，信号的强度可以积分，其强度表示在任一频率下共振的质子数。
用于核磁共振谱测量的溶剂必须是惰性的和不含质子的。因此使用得溶剂局限于四氯化碳（CCl4）、氘氯仿（CDCl3）、重水（D2O）、氘丙酮（CD3COCD3）或氘二甲基亚砜（(CD3)2-S=O）。极性化合物常常微溶于或不溶于所用的溶剂中，必须把它们转化为三甲基硅醚进行测量（见图1.7）。至少需要5-10mg样品，这就限制了核磁共振谱在许多植物化学实验中的应用。但是只需mg量分析样品的仪器正在起用。核磁共振谱测定超过质谱法的一个优点是：在测定之后样品不发生变化，至少可以回收并用于其它测定。
正如其他波谱测量一样，质子核磁共振谱测定可以作为植物化学家的指纹技术。但是，必须记住，波谱的复杂性与存在的不同类型的质子数直接相关。因此，一个高度取代的复杂生物碱给出的信号，可能比一个简单的脂肪烃少。核磁共振谱的主要用途是与其它波谱技术结合进行结构测定。它在测定化合物的类别方面是十分重要的。表1.4中列出一些典型的天然产物类的化学位移例子。芳香族的质子（在苯衍生物或杂环化合物中）明显地不同于脂肪族化合物的质子，而且在一类化合物内，核磁共振光谱测量常常还能作为鉴定个别结构的方法。
质子核磁共振谱可能是十分复杂的，例如由于连接到相邻碳原子上的质子之间的相互作用，波谱的信号可能呈现“双峰”或“三峰”，而不是单峰。因此谱图的解释要求许多技巧。尽管如此，无需非常详细分析波谱就可以获得有用的植物化学信息。这里举两个例子。第一，在测定苹婆酸（Sterculic acid）的结构时，化学家们起初不能接受这个独特的脂肪酸在其结构中有一个明显紧张的环丙烯环，而选择另一个分子式-双键位于邻接环丙烷环的位置上。但是核磁共振谱清楚地表明，该化合物必定有一个环丙烯环，因为在烯烃区（5.2-5.7δ）没有质子信号，因此另一个分子式是不可能的。
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