阿司匹林是种常用非甾抗炎药近研究表明它可能通过靶向乙酰肝素酶抑制肿瘤转移及肿瘤血管生成。乙酰肝素酶是种对血小板活化和血栓形成起关键作用酶它在肿瘤转移和肿瘤血管生成中也发挥着重要作用。研究发现阿司匹林可以抑制乙酰肝素酶活性从减少肿瘤细胞转移能力和抑制新血管形成进抑制肿瘤生长和扩散。这发现为阿司匹林在肿瘤治疗领域应用提供了新理论基础也为寻找新肿瘤治疗药物提供了新思路。
研究背景
非甾体类抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS）为结构中不含有甾体类结构的一类抗炎药物，而阿司匹林（aspirin）更是被称为“一大神药”，作为NSAIDS中的代表药在临床上已应用百年有余。长期积累的丰富临床经验使得人们对阿司匹林抗炎作用以外或由抗炎作用所衍生的临床应用有了新的拓展。在过去30年间，许多研究发现长期服用阿司匹林等NSAIDS能显著降低肿瘤发生率、延缓恶性肿瘤病程、减少肿瘤远端转移发生风险及降低肿瘤死亡率。但同时，也有研究表明健康人群长期服用阿司匹林或弊大于利。阿司匹林的多靶点特性是导致阿司匹林是否能够抗肿瘤争论的原因之一，由于阿司匹林抗肿瘤的多靶点性，其抗肿瘤的作用机制尚未明确阐述。目前认为其主要通过COX-2依赖与非依赖两种途径发挥作用，以前人们趋向于将阿司匹林的抗肿瘤作用归功于对COX-2的抑制，现在越来越多的证据表明阿司匹林通过COX非依赖性途径发挥作用。上海药物研究所的研究人员通过蛋白质组学的研究发现乙酰肝素酶是阿司匹林的一种相关作用蛋白，由于乙酰肝素酶在肿瘤的发生发展过程中起着重要的促进作用，作者猜想阿司匹林可以通过靶向乙酰肝素酶发挥抑制肿瘤的作用。
文章Aspirin Inhibits Cancer Metastasis and Angiogenesis via Targeting Heparanase于10月发表在Cinical Cancer Research上，IF：10.199，通讯作者：丁健，耿美玉，谭敏佳， 单位：中国科学院上海药物研究所
第一部分
阿司匹林能够抑制乙酰肝素酶活性
为了确定乙酰肝素酶为肿瘤细胞内阿司匹林的潜在靶点，作者使用生物素标记的阿司匹林作为化学探针来筛选阿司匹林相关作用蛋白，并通过质谱检测发现乙酰肝素酶是一种潜在的阿司匹林相关作用蛋白。通过将生物素或生物素-阿司匹林分别与MDA-MB-435和U87-HPA这两种稳定转染乙酰肝素酶的肿瘤细胞裂解物共孵育，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，发现乙酰肝素酶能够被生物素-阿司匹林拉低，但不被生物素拉低。并且更高浓度的未标记阿司匹林能够竞争乙酰肝素酶与生物素-阿司匹林的结合，表明阿司匹林能与乙酰肝素酶的特异性结合。
通过对实验室所储备的478个临床使用的乙酰肝素酶小分子抑制剂库进行筛选，结果发现在这些化合物中绝大多数对乙酰肝素酶是没有抑制作用的，但作者从中发现阿司匹林具有明显的抑制乙酰肝素酶活性的作用。为了确证这一结果，作者对阿司匹林抑制乙酰肝素酶酶活作用进一步做了评价，结果显示，随着浓度的增加阿司匹林能够剂量依赖性地抑制乙酰肝素酶酶活作用。同时，作者使用不同浓度的阿司匹林分别对四种肿瘤细胞(B16F10、CHO-K1、MDA-MB-435、U87-MG)进行处理后通过HTRF检测，发现阿司匹林能够剂量依赖性抑制这些癌细胞中乙酰肝素酶的活性。
那么阿司匹林是通过与乙酰肝素酶的什么部位相结合起到抑制乙酰肝素酶活性的作用呢?由于底物竞争是小分子抑制剂抑制乙酰肝素酶活性的常见机制。作者首先使用了表面等离子体共振法(SPR)测试阿司匹林是否能够与乙酰肝素酶的肝素结合结构域直接结合。通过对已知介导肝素和硫酸乙酰肝素与乙酰肝素酶结合的三个结构域(KKDC，QPLK，KKLR)进行测试，并没有观察到阿司匹林与这些结构域中的任何一个结合，表明阿司匹林可能与非肝素结合位点结合。
于是作者使用人类乙酰肝素酶的同源模型进行分子对接，探索阿司匹林与乙酰肝素酶可能的结合位点。通过比较阿司匹林、生物素-阿司匹林以及水杨酸(阿司匹林在细胞内的主要水解产物)与乙酰肝素酶的结合模式，并使用点突变的方式进行验证，发现了乙酰肝素酶Glu225，Lys231，Gln157和Lys159区域在这些相互作用中的重要作用。进一步验证这些点突变对乙酰肝素酶活性的影响，结果发现Glu225是唯一一个能够导致乙酰肝素酶失活的区域。由此，作者猜测，阿司匹林可能通过直接与乙酰肝素酶的Glu225区域结合以抑制乙酰肝素酶的活性。
第二部分
阿司匹林对乙酰肝素酶引起的肿瘤转移及肿瘤血管生成起抑制作用
由于乙酰肝素酶与肿瘤细胞的转移潜能相关，作者使用transwell小室来测试阿司匹林对乙酰肝素酶所促进的肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。用阿司匹林处理乙酰肝素酶高表达的B16F10和MDA-MB-435细胞，结果显示，阿司匹林能剂量依赖性地抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。
而在乙酰肝素酶高表达或敲低的情况下，阿司匹林抑制肿瘤细胞迁移和侵袭能力的作用被明显削弱。同时，外源性加入乙酰肝素酶能够逆转由阿司匹林引起的细胞受损。考虑到阿司匹林具有COX依赖性抗肿瘤活性，作者使用siRNA来敲低COX探索阿司匹林作用是否受到影响，结果显示，无论敲低COX-1或COX-2的表达，阿司匹林都能够显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。以上实验结果共同表明阿司匹林在抑制癌细胞迁移和侵袭中的乙酰肝素酶依赖性作用。
乙酰肝素酶能够促进释放VEGF和其他硫酸乙酰肝素结合的血管生成生长因子，加速促血管生成因子驱动的血管生成。因此，作者检查了阿司匹林对肿瘤细胞中VEGF释放的影响。通过ELISA测量分泌到癌细胞培养基中的VEGF水平，结果显示，阿司匹林治疗后显著抑制了MDA-MB-435和U87-MG细胞中VEGF的释放。而CHO细胞中的乙酰肝素酶过表达或MDA-MB-435细胞中的沉默逆转了阿司匹林的作用。在8小时经血清刺激后HUVEC细胞能够在基质胶上形成完整的网络结构，而阿司匹林治疗后，血管形成受到剂量依赖性抑制。同样，即使存在COX抑制剂塞来昔布或罗非考昔，阿司匹林也可抑制小管形成。
作者使用大鼠主动脉芽生长实验进一步证实了阿司匹林的抗血管生成作用，大鼠主动脉芽生长实验概括了血管生成过程中的几个关键步骤，结果发现4mM的阿司匹林能够完全抑制大鼠主动脉芽的生长。此外，作者还使用鸡胚绒毛尿囊膜模型测定(CAM)检查了阿司匹林对新血管形成过程的影响，类似的，与未处理的对照相比，当用阿司匹林处理时，鸡胚中的新血管形成被显著抑制。所有这些结果表明阿司匹林在体外和离体实验中具有靶向乙酰肝素酶抗血管生成潜力。
第三部分
阿司匹林对乙酰肝素酶体内生物学效应评价
以上实验结果表明体外阿司匹林的乙酰肝素酶依赖性抗转移和抗血管生成活性。作者进一步证实了体内效应。分别使用鼠B16F10实验性肺转移模型及MDA-MB-231肺转移模型评估阿司匹林的抗转移潜力，结果发现在这两种模型中阿司匹林都可以降低肿瘤转移数量并抑制体内转移发生率。作者还通过在裸鼠皮下注射人乳腺癌MDA-MB-435细胞来检查阿司匹林在乙酰肝素酶相关异种移植模型中的抗血管生成活性，并对血管生成进行评估。给药20天后，在阿司匹林治疗组中观察到肿瘤生长受到抑制，阿司匹林处理组显示CD31阳性微血管相对于对照显著减少，同时，肿瘤内乙酰肝素酶关键的下游信号分子的磷酸化现象也被明显抑制。至此，作者在体内动物模型中证实了阿司匹林靶向乙酰肝素酶抑制肿瘤转移及肿瘤血管生成的作用。
总结
以阿司匹林为代表的非甾体类抗炎药抗肿瘤作用已被社会广泛认知，但是其作用机制仍存争议。目前已报道阿司匹林除去环氧合酶COX外还具有大量的分子靶点：如激活AMPK、靶向mTOR等。本文研究中，作者将乙酰肝素酶确定为阿司匹林的潜在靶点之一，并证明了乙酰肝素酶相关的抗癌活性，特别是抗转移和抗血管生成活性。
乙酰肝素酶导致硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)降解，并引发硫酸乙酰肝素(HS)链结合血管生成因子如VEGF，HGF和bFGF等的释放，导致对于血管生成有利的肿瘤微环境的形成。本研究采用HTRF筛选平台证实了阿司匹林具有抑制乙酰肝素酶活性的作用，乙酰肝素酶为其靶点之一。通过免疫共沉淀结合冷探针实验证明了阿司匹林与乙酰肝素酶能够直接结合，并通过SPR和分子对接证明阿司匹林可能通过结合于乙酰肝素酶的Glu225活性区域，而非肝素结合区，进而发挥乙酰肝素酶酶活抑制作用。
研究证实了阿司匹林作为乙酰肝素酶抑制剂，能够抑制乙酰肝素酶诱发的相关效应：肿瘤细胞迁移与侵袭、VEGF的释放、血管新生以及信号通路的活化。为更好地了解阿司匹林在抗肿瘤转移作用中的作用机制提供了新的见解，为开发小分子乙酰肝素酶抑制剂提供了新的方向。
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